针对多个目标物的高灵敏定量检测在临床诊断中具有重要意义。宫颈癌是第四大常见癌症，被世界卫生组织认定为导致女性患病和死亡的主要原因之一，也是目前唯一病因明确且可早期预防、有望被消灭的癌症。高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）的早期检测和基因分型对宫颈癌的筛查、诊断和治疗极为重要，WHO指南中引入HPV-DNA检测作为宫颈癌筛查的首选方法。但是，传统检测方法依赖于核酸扩增技术，存在探针设计繁琐、环境仪器要求高等不足。近年来，CRISPR-Cas技术赋予了核酸、蛋白质等检测的高灵敏、高特异性以及耗时短、仪器需求低等优势，然而由于该技术（Cas12、Cas13等）固有的非特异性单链核酸切割活性，缺乏多靶标分析能力。因此，迫切需要开发基于CRISPR-Cas平台的简单、灵敏度高、特异性强、无需核酸扩增的多重检测方法。
近日，四川大学吴尧研究员团队提出了一种基于多重CRISPR-Cas12a的电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）生物检测策略，结合DNA框架结构功能化的磁珠，凭借其三重信号自放大效应，实现了对HR-HPV-DNA的多重检测和基因分型（图1）。首先，区别于传统的CRISPR生物传感器，该策略针对HPV-16、HPV-18、HPV-52三种基因序列实施空间独立的pre-CRISPR反应，实现独立高效的多重检测。随后，三种分型分别与Au、Ag、Pt纳米粒子的元素标记检测对应结合，ICP-MS技术不仅可同时输出多个信号，而且将输出信号进一步增强放大。此外，将DNA框架结构引入磁珠界面，与单链DNA探针相比，DNA框架结构不但保证了探针的取向而且提高了杂交效率，探针之间足够的空间促进了其与金属纳米粒子一对一的结合概率，提高了该方法的检测灵敏度。
图1. 基于DNA框架结构CRISPR三重自放大策略的多重DNA检测方法。
作者以HPV-16为靶标，考察该策略的可行性和检测性能（图2），并对DNA框架结构的检测信号增强效应进行探究。经过一系列的参数优化，该策略可同时对三种HR-HPV-DNA（HPV-16、HPV-18、HPV-52）相关序列进行定量分析（图3），三种靶标在0.1~50 pM范围内呈现良好的线性关系，建立校准曲线后，在充分考虑截距、斜率不确定度以及无需依赖核酸扩增手段的情况下，最低检测限达200 fM。而与此对比的单链DNA修饰的磁珠体系靶标检测线为2.24 pM。即DNA框架结构的引入不仅获得更宽的检测范围，且信号增强10倍左右。
图2. 策略可行性以及DNA框架结构信号增强效应探究。（a, b）可行性探究；（c）DNA框架结构和DNA单链结构的信号对比；（d）DNA框架结构增强信号示意图。
图3. 多重检测的分析性能；（a, b, c）HPV-DNA（HPV-16、HPV-18、HPV-52）与ICP-MS（197Au、107Ag、195Pt）的校准曲线；(d) 单链DNA探针界面，HPV-16与197Au的校准曲线。
与荧光标记检测方法相比，元素标记的ICP-MS技术不受光谱重叠、散射背景和生物基质物质干扰的限制，具有质量特定的单元素分辨率、多信号分析的高通量、元素之间无干扰等优点，被认为是一种理想的多元分析工具。作者进一步考察了该策略用于多目标物检测的选择性和特异性（图4），结果表明，基于ICP-MS技术的多重检测策略具有良好的选择性和特异性。考虑到DNA框架结构、CRISPR Cas系统和ICP-MS检测技术等的集成效果，初步探索该策略在临床应用中的实用性。作者对15份人宫颈拭子样本的DNA提取物进行检测，并与DNA测序等方法进行比对。结果表明，多重检测结果一致。综上，本论文的设计为基于CRISPR技术的多种DNA靶标简便、灵敏、准确检测提供了新方法，也为ICP-MS技术的多重分析检测实际应用提供新的思路。
图4. 多重检测的分析性能；（a, b）多重检测选择性和特异性评估；(c) 临床样本的方法学比对。
相关研究结果发表在Biosensors and Bioelectronics 上，四川大学博士研究生战晓辉和华西医院实验医学科周娟副主任技师为文章的共同第一作者，吴尧研究员和蓝芳研究员为共同通讯作者。
原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：
DNA tetrahedron-based CRISPR bioassay for treble-self-amplified and multiplex HPV-DNA detection with elemental tagging
Xiaohui Zhan, Juan Zhou, Yujia Jiang, Peng An, Bin Luo, Fang Lan, Binwu Ying, Yao Wu
Biosens. Bioelectron., 2023, DOI: 10.1016/j.bios.2023.115229
通讯作者信息
吴尧：四川大学研究员，博士生导师。四川大学“生物材料表界面及体外诊断”研究团队组长。教育部新世纪优秀人才，四川省学术和技术带头人，中国生物材料学会理事兼组织委员会委员，四川省生物医学工程学会常务理事兼秘书长，中国知识产权学会常务理事，中国科学基金第七届编委会编委。获教育部自然科学一等奖。围绕磁性功能纳米材料的可控构筑，致力于解决骨缺损修复以及重大疾病的临床诊治需求等挑战工作。主持国家自然科学基金面上项目、973项目子课题、四川省科技厅重点研发项目等16项，横向项目2项。累计获批经费近3000万元。授权中国发明专利约30项。发表SCI论文100余篇。论文总引用超过3000次，h-index=27。
https://www.x-mol.com/groups/Wu_Yao
蓝芳：四川大学研究员，博士生导师。中国人体健康科技促进会临床检验科学技术转化专业委员会委员。获唐立新优秀学者和好未来优秀学者奖。长期从事纳米生物医学材料和医疗器械材料表界面等研究，包括基于蛋白质、肽段、DNA和代谢物的疾病早期诊断和预后监测，以及微环境响应的生物材料表界面改性等应用。主持包括国家自然科学基金委面上项目和青年项目、“十三五”重点研发计划项目子课题、教育部博士点项目、四川省科技计划项目，及四川大学优秀青年学者研究基金（A类）等13项。以第一作者或通讯作者发表SCI源刊论文40余篇，授权中国发明专利18项，参与编写生物材料专著1部。
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